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一、樣品類型與用量

• 蛋白提取物：≥50–100 μg

• 細胞：≥1×10? 個

• 動物組織：≥1–10 mg；植物組織：≥100 mg

• 體液（血清 / 血漿）：≥5 μL；腦脊液 / 尿液：≥10–50 μL

二、樣品質(zhì)量與純度

1. 無去垢劑 / 高聚物：嚴禁 SDS、Tween、NP?40、PEG、甘油等（干擾離子化、污染色譜柱 / 離子源）。

2. 無鹽 / 低電導(dǎo)：避免高濃度尿素、鹽酸胍、Tris、磷酸鹽、DTT、β?ME（鹽抑制電離、導(dǎo)致峰畸變）。

3. 純度達標：

• 膠內(nèi)酶解：SDS?PAGE 分離后考染可見清晰條帶，無雜帶污染。

• 溶液酶解：總蛋白純度 > 80%，無核酸 / 多糖 / 脂質(zhì)殘留。

4. 無蛋白酶 / 磷酸酶污染：防止降解與修飾丟失。

三、酶解與肽段要求（Bottom?up）

1. 酶解：用測序級胰蛋白酶（1:20–1:50，37℃，12–16 h），無自降解，肽段長度7–20 aa。

2. 脫鹽除雜：C18 柱脫鹽，去除未酶解蛋白、鹽、色素、脂質(zhì)。

3. 濃度與體積：肽段濃度0.1–1 μg/μL，體積5–20 μL（自動進樣器適配）。

4. 溶劑適配：溶解于0.1% 甲酸水溶液（或 5% 乙腈 + 0.1% 甲酸），避免純有機溶劑。

四、穩(wěn)定性與保存

• 新鮮制備：24 h 內(nèi)上機；短期（1–7 天）：4℃避光；長期：?80℃分裝凍存（避免反復(fù)凍融）。

• 無沉淀 / 團聚：肽段溶液澄清，無肉眼可見顆粒（堵塞色譜柱）。

五、Top?down（完整蛋白）額外要求

• 分子量：<150 kDa（抗體 / 融合蛋白可放寬）。

• 緩沖液：20–50 mM 乙酸銨（pH 6.5–7.5），無鹽、無去垢劑、無還原劑。

• 濃度：5–20 μM，體積10–50 μL。

六、常見拒收情況

• 含 SDS、Tween、PEG、甘油等去垢劑 / 高聚物。

• 高鹽（>50 mM）、高尿素（>2 M）、高 DTT（>1 mM）。

• 蛋白降解（條帶模糊、肽段峰雜亂）、酶解不。

• 樣品渾濁、有沉淀、顏色過深（色素干擾）。

• 濃度過低（<0.1 μg/μL）或體積不足（<5 μL）。